Sau khi hoàn tất nghĩa vụ vào tháng 7 năm 1987,[12] chàng thanh niên Nguyễn Anh Tuấn mới thoáng thấy ý định tu tập. Ông cho rằng việc mình trở về khỏe mạnh và việc chứng kiến các đồng đội hy sinh tại bệnh viện K đã góp phần thúc đẩy ước muốn tu trì của ông.[13] Ông tìm việc và trở thành kỹ sư lập trình ở khách sạn Majestic Saigon. Thời gian này, ông cảm thấy có ý định tu trì thôi thúc. Sau bài giảng của linh mục Huỳnh Công Minh về tu trì và thông báo Đại chủng viện mở lớp mới, ông đã đăng ký nhập học Đại chủng viện.[12] Trong thời gian sáu năm dự tu, ông tiếp tục công việc làm cũng như giảng dạy Tin học.[9] Từ tháng 10 năm 1993 đến tháng 6 năm 1999, ông học tại Đại chủng viện Thánh Giuse Sài Gòn. Thời gian là chủng sinh, ông đã được cử đến hỗ trợ mục vụ trong các tháng hè tại các giáo xứ thuộc Tổng giáo phận: Chí Hòa, An Phú, Gò Vấp, Gia Định và Phanxicô Xaviê. Ngày 19 tháng 3 năm 1999, ông thụ chức phó tế.[9]

Ông được thụ phong linh mục vào ngày 30 tháng 6 năm 1999 thuộc Tổng giáo phận Thành phố Hồ Chí Minh.[8] Châm ngôn đời linh mục của ông là: “Miễn sao Đức Kitô được rao giảng”  (Pl 1,18). Giai đoạn 1999 – 2001, ông là linh mục phụ tá giáo xứ Phú Nhuận (TP.HCM), trợ giảng môn sinh ngữ tại Đại chủng viện Thánh Giuse Sài Gòn.[11]

Sau hai năm làm linh mục, Tổng giám mục Gioan Baotixita Phạm Minh Mẫn cử linh mục Nguyễn Anh Tuấn đi học về chủ đề Gia đình tại Học viện Gia đình Gioan Phaolô II (Đại học Lateranensis, Roma), tốt nghiệp Tiến sĩ Thần học chuyên biệt về Hôn nhân Gia đình (2001 – 2006) và năm 2006 học thêm đào tạo ơn gọi tại Đại học Gregoriana, Roma. Trong giai đoạn này, ông có cơ hội tiếp xúc với các giáo sĩ cao cấp của Giáo hội Công giáo thuộc nhiều màu da, chủng tộc khác nhau. Nhắc về thời kỳ này, giám mục Tuấn cho rằng mình đã có những kinh nghiệm quý giá.[8]

Sau khi về Việt Nam, từ 2006 đến 2014, linh mục Nguyễn Anh Tuấn đảm nhận vai trò giáo sư các môn liên quan đến mục vụ gia đình tại Trung tâm Mục vụ Tổng giáo phận Thành phố Hồ Chí Minh.[11] Trong khoảng thời gian này, vấn đề mục vụ gia đình là công việc song hành và thường xuyên của linh mục Nguyễn Anh Tuấn. Ông cho biết hầu như không có tháng nào ông không có đồng hành cá nhân với những người gặp khó khăn trong đời sống hôn nhân gia đình và các cộng đoàn nhỏ.[8]

Đồng thời từ 2007, ông giữ thêm các chức như: giám đốc Nhà Huấn luyện Tiền chủng viện Thánh Phaolô Nguyễn Văn Lộc (Năm Dự bị Đại chủng viện) của tổng giáo phận và đảm nhận vai trò này đến năm 2013; Trưởng ban Mục Vụ Gia đình Tổng giáo phận (từ ngày 7 tháng 7 năm 2007).[8] Sau đó, ông được chọn làm Thư ký Ủy ban Mục Vụ Gia đình trực thuộc Hội đồng Giám mục Việt Nam; Thư ký Hội đồng Giám mục Việt Nam cho Giáo tỉnh Sài Gòn từ năm 2009 và từ năm 2014 là Chánh Văn phòng Hội đồng Giám mục Việt Nam.[8]